آزمون سمیت سلولی

تست MTT به عنوان تستی برای بررسی میزان زنده مانی سلول یا بررسی اثر سمیت دارو ها یا دیگر مکمل ها بر سلول است که با تاثیر بر روی اندامک های درون سلولی می تواند بین سلول زنده و مرده تمایز قائل شد.

فعالیت و سرعت تکثیر سلول ها ممکن است تحت تاثیر هورمون ها، فاکتورهای رشد، سایتوکاین ها و میتوژن ها افزایش داشته باشد یا تغییری نکند. همینطور بعضی از داروها و عوامل سایتوتوکسیک مثل داروهای ضد سرطان ممکن است باعث نکروز یا آپوپتوز سلول‌ها یا کاهش سرعت تکثیر و رشد و یا از بین رفتن ساختار سلول ها شود.

بررسی تکثیر و بقای سلولی از تکنیک های مهم و اساسی در آزمایشگاه های سلولی محسوب می شود. این بررسی نیازمند کمّی سازی دقیق تعداد سلول های زنده در محیط کشت سلولی است. بنابراین روش های محاسبه ی بقای سلولی جهت بهینه سازی شرایط کشت سلول، ارزیابی عوامل رشد سلولی، کشف آنتی بیوتیک ها و داروهای ضد سرطان، ارزیابی اثرات سمّی آلاینده های محیطی و مطالعات آپوپتوز ضروری هستند. برای چنین اهدافی روش های متعددی می توانند مورد استفاده قرار گیرند اما روش های غیرمستقیم با استفاده از نشانگرهای فلورسنت یا رنگ زا (کروموژن)، روش هایی بسیار سریع در مقیاس بزرگ را فراهم می کنند. از میان این روش ها، سنجش بقای سلولی با تست MTT پرکاربردترین روش محسوب می شود. پروتکل MTT ، یک روش رنگ سنجی برای بررسی تکثیر و بقای سلول ها است که در سال ۱۹۸۳ توسط Mossman معرفی گردید.

MTT assay  مخفف   MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromideمی باشد.  یک روش رنگ سنجی است که بر اساس احیا شدن و شکسته شدن کریستال های زرد رنگ تترازولیوم (معرف MTT ) به وسیله ی آنزیم سوکسینات دهیدروژناز و تشکیل کریستال های بنفش رنگ نا محلول انجام می شود. در این روش برخلاف سایر روش ها مراحل شستشو و جمع آوری سلول که اغلب باعث از دست رفتن تعدادی از سلول ها و افزایش خطای کار می شود، حذف شده و تمام مراحل آزمایش از ابتدای کشت سلول تا خواندن نتایج با فوتومتر و همچنین تفسیر این تست در یک میکرو پلیت انجام می شود؛ بنابراین تکرارپذیری، دقت و حساسیت آزمایش بالاست.

اساس پروتکل MTT مبتنی بر فعالیت میتوکندری

فعالیت میتوکندریایی در سلول های زنده به صورت پایدار است و بنابراین افزایش یا کاهش تعداد سلول های زنده به صورت خطی با فعالیت میتوکندری مرتبط است. رنگ تترازولیموم MTT در سلول های فعال (به لحاظ متابولیکی) احیا می شود. آنزیم های دهیدروژناز میتوکندریایی در سلول های زنده، حلقۀ تترازولیوم را شکسته و با تولید NADH و NADPH منجربه تشکیل رسوب نامحلول ارغوانی رنگ به نام فورمازان می شوند. این رسوب می تواند توسط ایزوپروپانول یا دی متیل سولفواکسید حل شود. از سوی دیگر، سلول های مرده، چنین توانایی را نداشته و بنابراین سیگنالی را نشان نمی دهند. در این روش، تشکیل رنگ به عنوان نشانگر سلول های زنده مورد استفاده قرار می گیرد. شدت رنگ تولید شده، در طول موج ۵۴۰ تا ۶۳۰ نانومتر اندازه گیری می شود و به طور مستقیم با تعداد سلول های زنده متناسب است.

کاربردهای مهم تست MTT

• اندازه ­گیری تکثیر سلولی در پاسخ به عوامل رشد، سایتوکاین­ها، میتوژن­ها و مواد مغذی
• تجزیه و تحلیل ترکیبات کشندۀ سلول یا متوقف کنندۀ رشد سلول مانند داروهای ضد سرطان، سموم، آلاینده­های محیط زیست و سایر عوامل دارویی
• ارزیابی واسطه­ های فیزیولوژیک و آنتی­بادی­های مهار کنندۀ رشد سلولی
• کشف دارو، غربالگری داروهای سمی و ضد سرطان
• مطالعۀ فعالیت سلول
• بررسی اتصالات سلولی
• مطالعات سمیّت شیمیایی

ایمنی بالا و فراهم نمودن یک سیستم رنگ سنجی و غیر رادیواکتیو از مزایای مهم این روش محسوب می شوند. استفاده از کیت های تجاری بسیار راحت است و حساسیت و دقت بالایی دارد. از سوی دیگر بازدهی بالایی برای اندازه گیری تکثیر، بقاء و مرگ و میر سلولی دارد و روش اجرای آن نیازی به مراحل وقت گیر شستشو و انتقال از یک پلیت به پلیت دیگر را ندارد. نمونه های مورد بررسی در این روش عبارتند از سلول های چسبنده یا معلق و سلول های تکثیر شونده یا غیر تکثیر شونده.

پروتکل تست MTT  

1. سلول های مورد نظر را  کشت داده که به تراکم یا تعداد مورد نظر برسند.
2. سلولهای را با انزیم تریپسین از فلاسک جدا کرده و سپس با لام نئوبار می شماریم
3. میزان مورد نیاز از سلول ها را در خانه های پلیت ۹۶ می ریزیم (seeding).
4. ۲۴ ساعت انکوباسیون.
5. دارو ها را می توان با دوز ها و روش های مختلف به سلول های هر خانه اضافه کرد (treatment).
6. بسته به نوع تست، ساعات انکوباسیون با دارو می تواند ۲۴، ۴۸ و یا ۷۲ ساعت باشد.
7. پس از انکوباسیون دارو، مایع رویی در هر خانه را خارج می کنیم.
8. 10 میکرولیتر محلول MTT به هر خانه اضافه می کنیم.
9. پس از گذشت ۳ تا ۴ ساعت، محلول را خارج می کنیم.
10. توسط DMSO که یک حلال قوی است، رسوب فورمازان موجود در خانه ها را حل می کنیم. (مقدار 100 میکرولیتر در هر خانه)
11. با استفاده از دستگاه الایزا  در ۵۷۰ نانومتر، جذب را خوانده و IC50 را محاسبه می کنیم.