آلودگی های رایج در کشت سلول و نحوه درمان آن ها

آلودگی کشت‌های سلولی  شایع‌ترین مشکلی است که در آزمایشگاه‌های کشت سلولی با آن مواجه می‌شویم و گاهی اوقات عواقب بسیار جدی را به همراه دارد. از آلاینده های کشت سلول  می توان به آلاینده های شیمیایی مانند ناخالصی های موجود در محیط،  اندوتوکسین ها و آلاینده های بیولوژیکی مانند باکتری ها، کپک ها، مخمرها، ویروس ها، مایکوپلاسما و همچنین آلودگی توسط رده های سلولی دیگر اشاره کرد.

در حالی که حذف کامل آلودگی غیرممکن است، می توان با به دست آوردن درک کامل از منابع آن ها و با پیروی از تکنیک های مختلف، فراوانی و جدیت آن را کاهش داد.

باکتری ها :

 باکتری ها معمولاً چند میکرومتر قطر دارند و می توانند اشکال مختلفی داشته باشند، از کروی گرفته تا میله و مارپیچ. به دلیل وجودشان در همه جا، اندازه و سرعت رشد بالا، همراه با مخمرها و کپک ها، شایع ترین آلاینده های بیولوژیکی هستند که در کشت سلولی با آن مواجه می شوند. آلودگی باکتریایی به راحتی با بازرسی بصری فلاسک (ظرف کشت)  چند روز پس از آلوده شدن آن شناسایی می شود. کشت های آلوده معمولاً کدر به نظر می رسند ، گاهی اوقات مثل یک لایه نازک روی سطح مشخص می شوند. افت ناگهانی PH محیط کشت نیز به کرات مشاهده می شود. در زیر یک میکروسکوپ کم قدرت، باکتری ها به صورت دانه های ریز و متحرک بین سلول ها ظاهر می شوند. تصاویر شبیه سازی شده زیر، سلول  آلوده به E. coli را نشان می دهد.

مخمر:

مخمرها میکروارگانیسم های یوکاریوتی تک سلولی در قلمرو قارچ ها هستند که اندازه آنها از چند میکرومتر (معمولا) تا  ۴۰ میکرو متغیر است.

مانند آلودگی باکتریها ، محیط کشت های آلوده به مخمرها کدر می شوند، به خصوص اگر آلودگی در مرحله پیشرفته باشد. ابتدا تغییر بسیار کمی در pH محیط رخ می دهد ، پس از افزایش آلودگی، pH معمولاً افزایش می یابد.

کپک ها :

کپک ها میکروارگانیسم های یوکاریوتی در قلمرو قارچ ها هستند که به صورت رشته های چند سلولی به نام هایف رشد می کنند. یک شبکه متصل از این رشته های چند سلولی حاوی هسته های ژنتیکی یکسان است و به آنها کلنی یا میسلیوم می گویند. مشابه آلودگی مخمری، pH کشت در مراحل اولیه آلودگی ثابت می ماند، سپس با آلوده شدن و کدر شدن کشت به سرعت افزایش می یابد.

در زیر میکروسکوپ، میسلیوم‌ها معمولاً به‌صورت رشته‌های نازک و پف‌مانند و گاهی به صورت توده‌های متراکم‌تر از هاگ ظاهر می‌شوند. هاگ های بسیاری از گونه های کپک می توانند در محیط های بسیار خشن و نامناسب در مرحله خواب خود زنده به مانند، فقط زمانی که با شرایط رشد مناسب مواجه شوند فعال می شوند.

مایکوپلاسما :

مایکوپلاسما باکتری های ساده ای هستند که فاقد دیواره سلولی هستند و کوچکترین ارگانیسم خودتکثیر شونده به حساب می آیند. به دلیل اندازه بسیار کوچک آنها (معمولاً کمتر از یک میکرومتر)، تشخیص مایکوپلاسما تا زمانی که به تراکم بسیار بالایی دست یابند و باعث تخریب کشت سلولی شوند بسیار دشوار است. تا آن زمان، اغلب هیچ نشانه قابل مشاهده ای از عفونت وجود ندارد. برخی از مایکوپلاسماهای با رشد آهسته ممکن است بدون ایجاد مرگ سلولی در کشت باقی بمانند، اما می توانند رفتار و متابولیسم سلول های میزبان در کشت را تغییر دهند. عفونت‌های مزمن مایکوپلاسما ممکن است خود را با کاهش سرعت تکثیر سلولی، کاهش چگالی اشباع و آگلوتیناسیون در کشت‌های سوسپانسیون نشان دهند.

با این حال، تنها راه مطمئن برای تشخیص آلودگی مایکوپلاسما، آزمایش دوره‌ای کشت‌ها با استفاده از رنگ‌آمیزی فلورسنت (به عنوان مثال، Hoechst 33258)، ELISA، PCR، رنگ‌آمیزی، اتورادیوگرافی، یا سنجش‌های میکروبیولوژیکی است.                         

آلودگی ۲ رده سلولی با یکدیگر( Cross-Contamination) :

در حالی که به اندازه آلودگی میکروبی رایج نیست، آلودگی متقاطع (Cross-Contamination) بسیاری از رده های سلولی با HeLa و سایر رده های سلولی در حال رشد سریع یک مشکل آشکار با عواقب جدی است. دریافت رده های سلولی از بانک‌های سلولی معتبر، بررسی دوره‌ای ویژگی‌های رده های سلولی وجلوگیری از آلودگی ، اقداماتی هستند که به شما در جلوگیری از آلودگی متقابل کمک می‌کنند. انگشت نگاری DNA، تجزیه و تحلیل کاریوتایپ و آنالیز ایزوتیپ می تواند وجود یا عدم وجود آلودگی متقاطع را در کشت های سلولی تایید کند.

روش های پیشگیری از آلودگی :

برای جلوگیری از آلودگی های رایج در صورت امکان باید یک آزمایشگاه جداگانه برای کشت سلولی و نگه­داری رده­‌های سلولی ایجاد شود. فراهم کردن چنین محیطی  باعث کاهش آلودگی می شود.

از آنجایی که انسان­‌ها منبع اصلی آلودگی هستند، مراحل پیشگیری از شما شروع می­شود. اگر به اندازه کافی مراقب باشید که محیطی استریل برای کار فراهم کنید، خیلی زود ، این امر به یک عادت تبدیل می‌شود. در این­جا چندین کار برای جلوگیری از آلودگی وجود دارد:

1.  در حین کار با رده های سلولی از روپوش و ماسک آزمایشگاهی تمیز استفاده کنید.
2. از گفتگو با سایر اعضای آزمایشگاه، عطسه یا سرفه در آزمایشگاه خودداری کنید. دهان انسان حاوی طیف گسترده­ای از مایکوپلاسماها است و این مایکوپلاسماها می‌توانند هنگام صحبت، خنده، عطسه یا سرفه وارد کشت سلولی شوند.
3. وسایل مصرفی حتما قبل از استفاده اتوکلاو شود.
4.  برای جلوگیری از ورود آلاینده‌های محیطی، کفش جداگانه‌ای برای آزمایشگاه داشته باشید.
5. هنگام کار از دستکش استفاده کنید و پس از استفاده آن را دور بیندازید. هنگامی که بدون دستکش یا ماسک کار می­کنید، تماس انسانی می‌تواند باعث ایجاد آلودگی شود.
6. دستگاه جریان هوای لامینار و تاسیسات آزمایشگاهی را به صورت دوره­ای ضد عفونی کنید.
7. انکوباتورهای CO2 که برای حفظ رده­‌های سلولی استفاده می­شوند، نباید بیش از حد پر شوند (بیش از 60 درصد ظرفیت آن)، زیرا می­‌تواند باعث سرایت آلودگی از یک رده سلولی به رده سلولی دیگر شود.
8.  انکوباتورهای CO2باید به طور منظم تمیز شوند و از هر نوع رطوبتی باید اجتناب شود. آب مقطر تهیه شده برای حفظ رطوبت، باید به طور منظم تعویض شود زیرا مایکوپلاسماها، باکتری­‌ها و قارچ‌­ها می‌­توانند به این ظروف وارد شوند.
9.  چندین رده سلولی نباید در یک انکوباتور ذخیره شوند زیرا خطر آلودگی متقاطع را افزایش می­‌دهد.
10. حمام‌­های آب، ظروف نیتروژن مایع، بطری‌­های شناسا­گرها و سایر منابع عفونت باید به طور مرتب تمیز شوند و به طور دوره­ای از نظر آلودگی بررسی شوند.

راه های درمان آلودگی :

بری از بین بردن آلودگی های میکروبی می توان از آنتی بیوتیک های مختلف استفاده کرد که البته به طور معمول در محیط های کشت سلول از آنتی بیوتیک pen-strep  به میزان ۱ درصد استفاده می شود.

آنتی بیوتیک ها نباید به طور معمول در کشت سلولی مورد استفاده قرار گیرند، زیرا استفاده مداوم از آنها باعث ایجاد سویه های مقاوم به آنتی بیوتیک می شود و اجازه می دهد تا آلودگی سطح پایین باقی بماند، که می تواند پس از حذف آنتی بیوتیک از محیط به آلودگی در مقیاس کامل تبدیل شود و ممکن است مایکوپلاسما را پنهان کند.علاوه بر این، برخی از آنتی بیوتیک ها ممکن است با سلول ها واکنش متقابل داشته باشند و در فرآیندهای سلولی مورد بررسی تداخل ایجاد کنند.

آنتی بیوتیک ها فقط باید به عنوان آخرین راه حل و فقط برای کاربردهای کوتاه مدت استفاده شوند و باید در اسرع وقت از کشت حذف شوند.

در این مقاله سعی شد مختصرا به آلودگی های رایج در کشت سلول و راه های جلوگیری و درمان آن پرداخته شود.