اصول کشت سلول ؛ انجماد و ذوب

همان طور که در مقاله ی پاساژ سلولی گفته شد اصول کشت سلولی بر مبنای ۳ اصل ۱:پاساژ سلولی (Subculturing) ۲: ذوب سلولی و ۳: انجماد سلولی می باشد؛ در این مقاله به بررسی ذوب و انجماد سلولی می پردازیم.

انجماد سلولی ( Freezing Cells ) :

رده های سلولی در کشت مداوم، مستعد جهش ژنتیکی هستند، همه کشت های سلولی مستعد آلودگی میکروبی هستند از آنجایی که یک رده سلولی ایجاد شده منبع ارزشمندی است و جایگزینی آن گران و زمان بر است، بسیار مهم است که آنها را منجمد کرده و برای طولانی مدت نگهداری کنیم.

بهترین روش برای انجماد سلول‌های کشت‌شده، نگهداری آن‌ها در نیتروژن مایع در محیط کامل در حضور یک عامل محافظ سرما مانند دی‌متیل سولفوکساید (DMSO) است. عوامل محافظت کننده برودتی نقطه انجماد محیط را کاهش می دهند و همچنین اجازه می دهند سرعت یخ زدن کمتر شود و خطر تشکیل کریستال یخ را تا حد زیادی کاهش می دهند که این مطلب بسیار حائز اهمیت است چون که تشکیل کریستال می تواند به سلول ها آسیب برساند و باعث مرگ سلولی شود.

قبل از بیان مواد و تجهیزات لازم ومراحل انجام کار به چند نکته مهم می پردازیم :

• سلول های کشت شده خود را با غلظت بالا و با کمترین تعداد پاساژ ممکن فریز کنید. قبل از انجماد مطمئن شوید که سلول ها حداقل ۹۰ درصد زنده هستند. توجه داشته باشید که شرایط انجماد بهینه به رده سلولی مورد استفاده بستگی دارد.
• سلول ها را به آرامی با کاهش دما در حدود ۱ درجه سانتی گراد در دقیقه با استفاده از یک فریزر با سرعت کنترل شده یا یک ظرف انجماد  مانند ظرف ایزوپروپانول ( Mr. Frosty ) فریز کنید.
• همیشه از محیط انجماد (Freezing Medium) توصیه شده استفاده کنید. محیط انجماد باید حاوی یک عامل محافظ برودتی مانند DMSO یا گلیسرول باشد.
• سلول های یخ زده را دردمای زیر 70- درجه سانتی گراد نگهداری کنید. سلول های منجمد در دمای بالای 50- درجه سانتیگراد شروع به تخریب شدن می کنند.
• همیشه از کرایویال های استریل برای نگهداری سلول های منجمد استفاده کنید.
• تمامی محلول ها و تجهیزاتی که با سلول ها در تماس هستند باید استریل باشند. همیشه از تکنیک استریل مناسب استفاده کنید و در زیر هود  کار کنید.

مواد و تجهیزات لازم :

• ظرف های کشت حاوی سلول های کشت شده که در فاز لگاریتمی رشد هستند.
• محیط کشت کامل
• عامل محافظت از سرما مانند DMSO یا یک محیط انجماد
• لوله های فالکون ۱۵ میلی لیتری یا ۵۰ میلی لیتری استریل یکبار مصرف
• معرف‌ها و تجهیزات برای تعیین تعداد سلول‌های زنده و کل سلول ها مانند : لام نئوبار و تریپان بلو
• ویال های نگهداری برودتی استریل (به عنوان مثال، کرایویال ها)
• دستگاه انجماد با سرعت کنترل شده یا محفظه ایزوپروپانول (Mr. Frosty )
• تانک های  نیتروژن مایع برای انجماد سلول های چسبنده
• محلول نمک مانند نمک بافر بافر فسفات (D-PBS)
• انزیم تفکیک مانند تریپسین

مراحل انجام کار :

پروتکل زیر یک روش کلی برای انجماد سلول های کشت شده را توضیح می دهد

1. محیط انجماد را آماده کنید و تا زمان استفاده در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتیگراد نگهداری کنید. (توجه داشته باشید که محیط انجماد مناسب به رده سلولی متغیر می باشد) یا می توان از DMSO ۱۰ درصد و محیط کامل هم استفاده کرد.

2. برای سلول های چسبنده، سلول ها را به آرامی از ظروف کشت  به دنبال روشی که در طی پاساژ استفاده می شود جدا کنید. سلول ها را در محیط کامل مورد نیاز برای آن نوع سلول مجدداً معلق کنید.

3. تعداد کل سلول ها و درصد زنده ماندن را با استفاده از شمارنده سلولی و یا لام نئوبار و تریپان بلو محاسبه کنید.

4. سوسپانسیون سلولی را در در 100 xg  به مدت ۵ تا ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ کنید.

توجه: سرعت و مدت سانتریفیوژ بسته به نوع سلول متفاوت است.

5. رسوب سلولی را مجدداً در محیط انجماد معلق کنید.

6.  مقداری از سوسپانسیون سلولی را درکرایوویال بریزید . همانطور که آنها را به مقدار کافی تقسیم می کنید، به طور مکرر و به آرامی سلول ها را پایپت کنید تا  سوسپانسیون سلولی همگن حفظ شود.

7. کرایویال های حاوی سلول ها را در یک محفظه ایزوپروپانول ( Mr. Frosty  ) و  در دمای 80- درجه سانتیگراد به مدت یک شب نگهداری کنید. یا به مدت ۱ الی ۲ ساعت در 20- درجه سانتیگراد قرار دهید و سپس در 80- درجه سانتیگراد بگذارید.

8. سلول های منجمد را به تانک نیتروژن مایع منتقل کنید.

ذوب سلولی :

 ذوب  برای سلول های منجمد استرس زا است، و استفاده از تکنیک خوب و کار سریع تضمین می کند که نسبت بالایی از سلول ها  زنده بمانند.

قبل از بیان مواد و تجهیزات لازم ومراحل انجام کار به چند نکته مهم می پردازیم :

• سلول ها را به سرعت (کمتر از ۱ دقیقه) در حمام آب ۳۷ درجه سانتی گراد ذوب کنید.

• سلول های ذوب شده را با استفاده از محیط کشت از قبل گرم شده به آرامی رقیق کنید.

• همیشه از تجهیزات حفاظتی ، از جمله ماسک صورت یا عینک استفاده کنید. کرایویال‌هایی که در فاز مایع ذخیره می‌شوند، هنگام ذوب شدن، خطر انفجار را دارند.

مواد و تجهیزات لازم :

• کریوویال حاوی سلول های منجمد

• محیط کشت کامل، از قبل گرم شده تا ۳۷ درجه سانتیگراد

• لوله های فالکون استریل یکبار مصرف

• حمام آب در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد

• فلاسک ها یا ظروف کشت

مراحل  ذوب سلولی :

 پروتکل زیر یک روش کلی برای ذوب سلول های منجمد شده را توضیح می دهد.

1. کرایویال حاوی سلول های منجمد را از تانک نیتروژن مایع خارج کرده و بلافاصله آن را در حمام آب ۳۷ درجه سانتی گراد قرار دهید.

2. با چرخاندن آرام ویال در حمام آب ۳۷ درجه سانتیگراد، سلولها را به سرعت (کمتر از ۱ دقیقه) ذوب کنید تا مقدار کمی یخ در ویال باقی بماند.

3. ویال را به زیر هود  منتقل کنید. قبل از باز کردن، قسمت بیرونی ویال را با اتانول ۷۰ درصد پاک کنید.

4. سلول های ذوب شده را به صورت قطره ای و آرام به لوله فالکون حاوی مقدار مورد نظر محیط کشت کامل از قبل گرم شده ، مناسب برای رده سلولی خود منتقل کنید.

5. سوسپانسیون سلولی را در حدود 100 xg به مدت ۵ تا ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ کنید. سرعت و مدت سانتریفیوژ  بسته به نوع سلول متفاوت است.

6. پس از سانتریفیوژ، مایع رویی را دور بریزید(مراقب باشید که رسوب سلولی را موقع تخلیه مایع رویی از دست ندهید).

7. سلول ها را به آرامی در محیط کشت کامل معلق کنید و آنها را به ظرف کشت مناسب و به محیط کشت توصیه شده منتقل کنید.

توجه: اندازه فلاسک مناسب به تعداد سلول های منجمد شده در کریوویال بستگی دارد و محیط کشت بر اساس نوع سلول و محیط متفاوت است.

در این مقاله و مقاله ی پاساژ سلولی سعی شد به مبانی اصول کشت سلول پرداخته شود و به صورت کلی مراحل آن مرور شود تا پژوهشگران بتوانند بهتر و مسلط تر به کار عملی در آزمایشگاه، که مهم ترین قسمت در کار های حوزه ی زیست شناسی است بپردازند.