اصول کشت سلول ؛ پاساژ سلولی

همان طور که در مقالات قبل گفته شد هدف اصلی کشت سلولی رشد و نگهداری سلول‌ها در خارج از محیط طبیعی، فراهم کردن یک محیط کنترل‌شده برای مطالعه رفتار سلولی، انجام آزمایش‌ها و تولید محصولات بیولوژیکی است.

توسعه محیط‌های کشت پایه، دانشمندان را قادر می‌سازد تا با طیف وسیعی از سلول‌ها تحت شرایط کنترل‌شده کار کنند. این موضوع نقش مهمی در پیشبرد درک ما از رشد و تمایز سلولی، شناسایی فاکتورهای رشد و درک مکانیسم‌های سلولی دارد.

اصول کشت سلولی بر مبنای ۳ اصل ۱:پاساژ سلولی (Subculturing) ۲: ذوب سلولی و ۳: انجماد سلولی می باشد

در این مقاله مفصلا به بررسی پاساژ سلولی می پردازیم:

پاساژ سلول های چسبنده :

پروتکل زیر یک روش کلی برای زیر کشت سلول های چسبنده در کشت را شرح می دهد. برای پاساژ از رده سلولی خود، توصیه می کنیم دستورالعمل های ارائه شده با هر محصولی را که در آزمایشات خود استفاده می کنید، به دقت مطالعه کنید.

مواد و تجهیزات لازم :

• ظروف کشت حاوی سلول های چسبنده شما

• فلاسک ها،  یا ظروف کشت جدید

• محیط رشد کامل، از قبل گرم شده تا ۳۷ درجه سانتیگراد

• لوله فالکون های استریل ۱۵ میلی لیتری یکبار مصرف

• انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد با اتمسفر مرطوب با CO2 ۵ درصد  

• محلول نمک متعادل مانند نمک بافر فسفات  (PBS)، فاقد کلسیم، منیزیم، یا فنل قرمز

• آنزیم تفکیک مانند تریپسین ،

• معرف‌ها و تجهیزات برای تعیین تعداد سلول‌های زنده مانند تریپان بلو و لام نئوبار و...

نکته : تمام محلول ها و تجهیزاتی که با سلول ها در تماس هستند باید استریل باشند.

مراحل انجام پاساژ سلولی

• محیط کشت سلولی مصرف شده را از ظرف کشت خارج کرده و دور بریزید.
• سلول ها را با استفاده از محلول نمک متعادل بدون کلسیم و منیزیم (تقریباً ۲ میلی لیتر در هر ۱۰ سانتی متر مربع سطح کشت) بشویید. محلول شستشو را به آرامی بر روی سلول ها ریخته و ظرف را چندین بار به جلو و عقب تکان دهید.
• توجه: مرحله شستشو هرگونه اثری از سرم، کلسیم و منیزیم را که مانع از عمل آنزیم تفکیک شود، از بین می برد.
• محلول شستشو را از ظرف کشت خارج کرده و دور بریزید.
• آنریم تفکیک از قبل گرم شده مانند تریپسین  را به کناره فلاسک اضافه کنید. (تقریباً ۰.۵ میلی لیتر در هر ۱۰ سانتی متر مربع). به آرامی ظرف را تکان دهید تا کامل کف ظرف را بپوشاند.
• ظرف کشت را به مدت تقریبی ۲ دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید. توجه داشته باشید که زمان انکوباسیون  با توجه به  رده سلولی مورد استفاده متفاوت است.
• سلول ها را در زیر میکروسکوپ برای جدا شدن مشاهده کنید. اگر کمتر از ۹۰ درصد سلول‌ها جدا شده‌اند، زمان انکوباسیون را چند دقیقه دیگر افزایش دهید و هر۳۰ ثانیه یکبار  بررسی کنید. همچنین می‌توانید برای تسریع جدا شدن سلول، به ظرف کشت ضربه بزنید.
• هنگامی که ۹۰ درصد از سلول ها جدا شدند، مقدار دو برابر حجم مورد استفاده از آنزیم تفکیک ، محیط رشد کامل از قبل گرم شده را اضافه کنید. محیط را با پیپت کردن چندین بار روی سطح لایه سلولی پخش کنید.
• سلول ها را به یک لوله فالکون ۱۵ میلی لیتری منتقل کنید و سپس در دور  200xg به مدت ۵ تا ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ کنید. توجه داشته باشید که سرعت و زمان سانتریفیوژ بر اساس نوع سلول متفاوت است.
• رسوب سلولی را در حداقل حجم از محیط رشد کامل از قبل گرم شده مجدداً معلق کنید و نمونه ای را برای شمارش بردارید.
• تعداد کل سلول ها و درصد زنده ماندن را می توان با استفاده از لام نئوبار و رنگ تریپان بلو محاسبه کرد.
• حجم مناسب را در ظروف های کشت سلولی جدید بریزید و سلول ها را به انکوباتور برگردانید.

پاساژ سلول های سوسپانسیون یا معلق

پاساژ یا زیر کشت سلول های سوسپانسیون تا حدودی پیچیدگی کمتری نسبت به عبور سلول های چسبنده دارد. از آنجایی که سلول‌ها قبلاً در محیط رشد معلق هستند، برای جدا کردن آنها از سطح ظرف کشت، نیازی به استفاده آنزیمی نیست و کل فرآیند برای سلول‌ها سریع‌تر  است. تعویض محیط  در کشت های سوسپانسیون انجام نمی شود. این کار را می‌توان با رقیق کردن مستقیم سلول‌ها در فلاسک کشت و ادامه گسترش آنها، یا با خارج کردن بخشی از سلول‌ها از فلاسک کشت و رقیق کردن سلول‌های باقی‌مانده تا تراکم  مناسب برای رده سلولی انجام داد. معمولاً دوره پاساژ سلولی  این ها کوتاه‌تر از سلول های چسبنده است.

کشت های سوسپانسیون را می توان در فلاسک های کشت استریل (مانند فلاسک های شیکر بدون بافل) که تحت کشت بافتی قرار نمی گیرند، نگهداری کرد. با این حال، فلاسک های اسپینر (یعنی بطری های همزن) که به طور خاص برای کشت سلولی سوسپانسیون طراحی شده اند، امکان تبادل گاز بهتر را فراهم می کنند و اجازه می دهند حجم های بالاتری از سلول ها کشت شوند.

فلاسک های اسپینر دو طرح اساسی دارند،(در شکل زیر مشاهده می کنید) محیط توسط یک مجموعه میله همزن آویزان یا با یک پروانه عمودی  هم زده می شود که پروانه عمودی هوادهی بهتری را فراهم می کند. حجم کل کشت در یک فلاسک اسپینر برای هوادهی مناسب نباید از نصف حجم مشخص شده در اسپینر تجاوز کند (به عنوان مثال، یک اسپینر ۵۰۰ میلی لیتری هرگز نباید بیش از ۲۵۰ میلی لیتر کشت داشته باشد.

    مواد و تجهیزات لازم :

• • ظرف های کشت حاوی سلول های  شما
  • فلاسک های شیکر بدون بافل  یا بطری های اسپینر
  • محیط رشد کامل، از قبل گرم شده تا ۳۷ درجه سانتیگراد
  • انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد با اتمسفر مرطوب با CO2 ۵ درصد  
  • صفحه همزن مغناطیسی

سلول ها را زمانی که در فاز لگاریتمی رشد می کنند، قبل از رسیدن به تلاقی، پاساژ می دهند. هنگامی که آنها به تراکم(Confluency ) بالا می‌رسند، سلول‌های سوسپانسیون به هم می‌پیوندند و با چرخاندن فلاسک کشت، محیط کدر به نظر می‌رسد. حداکثر تراکم سلولی توصیه شده قبل از پاساژ در رده های سلولی متفاوت است.

پروتکل زیر یک روش کلی برای پاساژ سلول های پستانداران رشد یافته در کشت سوسپانسیون با استفاده از فلاسک های شیکر در انکوباتور را شرح می دهد.

توجه: مطمئن شوید که فلاسک شیکر دارای بافل نباشد (یعنی فرورفتگی‌های پایین فلاسک که برای هم زدن طراحی شده‌اند)، زیرا ریتم تکان دادن را خراب می‌کنند.

مراحل انجام پاساژ سلولی:

1. هنگامی که سلول ها برای پاساژ آماده شدند (یعنی در فاز رشد لگاریتمی)، فلاسک را از انکوباتور خارج کرده و با استفاده از یک پیپت استریل نمونه کوچکی ازسلول ها برداشته ، اگر قبل از نمونه برداری سلول ها ته نشین شده اند، فلاسک را بچرخانید تا سلول ها به طور یکنواخت در محیط توزیع شوند.

2. از نمونه، تعداد کل سلول ها و درصد زنده ماندن را با استفاده تریپان بلو و لام نئوبارتعیین کنید.

3. حجم محیطی را که باید برای رقیق کردن کشت برای تراکم مناسب محاسبه کنید و سپس اظافه کنید

4. حجم مناسبی از محیط رشد از قبل گرم شده را به صورت استریل به فلاسک کشت اضافه کنید. در صورت نیاز می توانید کشت را به چند فلاسک تقسیم کنید.

5. درپوش های فلاسک های کشت را یک دور کامل باز کنید تا تبادل گاز مناسب انجام شود (یا از درپوش قابل نفوذ گاز استفاده کنید)، و فلاسک ها را به انکوباتور تکان دهنده برگردانید.

توجه: برای به حداقل رساندن تجمع بقایای سلولی و محصولات جانبی ضایعات متابولیک در کشت های شیکر، سوسپانسیون سلولی را به آرامی در 100xg به مدت ۵ تا ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ کنید و گلوله سلولی را هر سه هفته یکبار در محیط رشد تازه حل کنید.