شمارش سلولی و تعیین زنده مانی سلول ها

شمارش سلول به شمردن یا اندازه گیری تعداد سلول ها ،گفته می شود که به ۲ روش لام هموسیتومتر (نئوبار) یا دستگاه cell counter  انجام می شود. این روش در علوم زیستی از جمله تشخیص های پزشکی و درمانی مورد استفاده قرار می گیرد. شمارش سلول ، زیر مجموعه  فلوسیتومتری بوده و کاربردهای آن در آزمایشگاه های تحقیقاتی و کلینیکال می باشد.

برای ریختن سلول ها در پلیت های چند خانه که اصطلاحا کاشت یا سید کردن (Seeding) گفته میشود، ابتدا نیاز هست که سلول های مورد نظر را بشماریم و همچنین برای محاسبه درصد زنده مانی نیاز به شمارش داریم که در این مقاله به آن می پردازیم.

روش زیر دستورالعمل  کلی در مورد نحوه استفاده ازلام نئوبار را ارائه می دهد.

1. ابتدا باید سلول های چسبیده را مانند آنچه در پاساژ سلول انجام می شود، تریپسینه کرده و پس از سانترفیوژ، مایع رویی را دور بریزید و رسوب سلولی را در یک میلی لیتر محیط کشت کامل معلق کنید.
2.  لام نئوبار را با الکل تمیز کنید و یک لامل روی آن بگذارید.
3.   ۱۰ میکرولیتر از سلول را برداشته (قبل از آن، خوب پایپت کنید تا یکدست شود) به آرامی به حد فاصل بین لامل و لام انتقال دهید. اجازه دهید که با عمل مویینگی تمام سطح زیر لامل را پر کند.
4.  لام نئوبار را در زیر میکروسکوپ معکوس  قرار دهید. هر طرف لام از ۹ مربع بزرگ تشکیل شده که روش شمارش سلول ها داخل این مربع ها میتواند متفاوت باشد. اکثرا به این صورت انجام می شود که ۴ مربع گوشه شمرده می شود حتما باید مربع ها را به ترتیب بشمارید تا فراموش نکنید کدام یک شمارش شده است. برای شمارش سلول هایی که روی ضلع های مربع قرار دارند یک قانون قراردادی می گذاریم، به صورتی که فقط ضلع های بالا و سمت چپ را بشماریم ( اگر از مربع بالا سمت چپ شمارش را آغاز کردید). شمارش سلول ها را به دقت انجام دهید.
5.  بعد از شمارش مربع ها، از اعداد میانگین بگیرید و سپس به صورت زیر تعداد کل سلول ها را محاسبه کنید.

غلظت سلول ها  به این صورت محاسبه می شود :

غلظت سلول = میانگین تعداد سلول زنده در هر مربع × ۱۰^۴

روش دیگر ، استفاده از تریپان بلو می باشد. در مواقعی که می خواهیم دقیق محاسبه زنده مانی انجام دهیم و یا تعداد سلول زیاد باشد، از این روش استفاده خواهیم کرد. پس روش زیر شما را قادر می سازد تا زنده مانی سلولی را به دقت تعیین کنید.

زنده مانی سلولی برابر است با تعداد سلول های زنده تقسیم بر تعداد کل سلول های شمرده شده.

 (اگر سلول‌ها  تریپان بلو را کامل جذب کنند ، مرده در نظر گرفته می‌شوند)

مراحل انجام کار :

1. محلول 0.4% تریپان بلو را در محلول نمک ایزوتونیک بافر، pH7.2  تا 7.3 تهیه کنید.
2. 10 میکرولیتر از سلول را درون یک لوله فالکون جدید ریخته و 10 میکرولیتر 0.4٪ تریپان بلو به آن اضافه کنید و به آرامی پایپت کنید تا کامل مخلوط شود.
3. با استفاده از پیپت، 10 میکرولیتر سوسپانسیون سلولی که با تریپان بلو مخلوظ شدند را به حد فاصل بین لامل و لام انتقال دهید. ، اجازه دهید که با عمل مویرگی تمام سطح زیرین را پر کند.
4. لام نئوبار را در زیر میکروسکوپ معکوس  قرار دهید. هر طرف لام از ۹ مربع بزرگ تشکیل شده که روش شمارش سلول ها داخل این مربع ها میتواند متفاوت باشد . ما به این صورت انجام می دهیم که ۴ مربع گوشه  را می‌شماریم حتما باید مربع ها را به ترتیب بشمارید تا فراموش نکنید کدام یک شمارش شده است . برای شمارش سلول هایی که روی ضلع های مربع قرار دارند یک قانون می گذاریم ، زیرا فقط ضلع های بالا و سمت چپ را بشماریم ( اگر از مربع بالا سمت چپ شمارش را آغاز کردید) . شمارش سلول ها را به دقت انجام دهید .
5. سلول های زنده دارای دبواره ای رنگ شده با تریپان بلو هستند ولی سلول های مرده یا تکه تکه اند یا رنگ آبی به سیتوپلاسمشان نفوذ کرده.
6. . تعداد سلول های رنگ آمیزی آبی و تعداد کل سلول ها را بشمارید. و به طور زیر محاسبه کنید

ضریب رقت =

 =2

غلظت سلول = میانگین تعداد سلول در هر مربع × ضرب رقت × ۱۰^۴

درصد سلول های زنده = × ۱۰۰

در نتیجه با این روش ها می توانیم شمارش سلولی و زنده مانی سلولی را محاسبه کنیم