محیط کشت، محیطی است که مواد مغذی، فاکتورهای رشد و هورمون های لازم برای رشد سلول را فراهم می کند و همچنین باعث تنظیم pH و فشار اسمزی می شود در نتیجه یک جزء بسیار مهم برای کشت سلولی است.
سه کلاس اصلی محیط ها شامل محیط‌های پایه (Basal Media)، محیط‌های کاهش‌یافته سرم(Reduced-Serum Media) و محیط‌های بدون سرم (serum-free media) هستند که تفاوت این کلاس های محیطی با یکدیگر، در مقدار سرم مورد نیاز آن ها برای کامل شدن محیط می باشد.
قبل از بررسی سه کلاس اصلی ذکر شده ، با مفهوم سرم آشنا می شویم:
سرم (Serum):
سرم مایعی است که پس از حذف فاکتورهای انعقادی از پلاسمای خون باقی می ماند و به عنوان منبع فاکتورهای رشد ، هورمون ها، لیپیدها و مواد معدنی برای کشت سلول اهمیت حیاتی دارد همچنین نفوذپذیری غشای سلولی را تنظیم می‌کند.
محیط های پایه (Basal Media):
اکثر رده‌های سلولی در محیط‌های پایه که حاوی اسیدهای آمینه، ویتامین‌ها، نمک‌های معدنی و منبع کربنی مانند گلوکز هستند به خوبی رشد می‌کنند. محیط های کشت پایه باید با سرم تکمیل شوند.
محیط های کاهش یافته سرم (Reduced-Serum Media):
محیط‌های کاهش‌یافته سرم ، بر مبنای محیط کشت پایه اما غنی شده با مواد مغذی و عوامل مشتق شده از حیوانات هستند که میزان سرم مورد نیاز را کاهش می‌دهند. یک استراتژی برای کاهش اثرات نامطلوب سرم در آزمایش های کشت سلولی ، استفاده از محیط های کاهش یافته سرم می باشد.
محیط‌های بدون سرم ( Serum-Free Media):
محیط های بدون سرم (SFM) می توانند با جایگزین کردن موادی با فرمولاسیون تغذیه ای و هورمونی مناسب، مشکلات مربوط به استفاده از سرم های حیوانی را حل کنند.
محیط های بدون سرم برای بسیاری از کشت‌های اولیه و رده های سلولی مانند تخمدان همستر چینی (CHO) ، رده‌های سلولی هیبریدوما ، رده های سلولی حشرات مانند Sf9 و Sf21 استفاده می شود و همچنین برای رده های سلولی ای که به عنوان میزبان برای تولید ویروس عمل می کنند (به عنوان مثالVERO ، MDCK، MDBK ) نیز کاربرد دارند.
مقدار pH :
اکثر رده های سلولی پستانداران در pH برابر ۷.۴ به خوبی رشد می کنند و تنوع بسیار کمی در بین سویه های سلولی مختلف از نظر سازگاری با pH وجود دارد. با این حال، نشان داده شده است که برخی از رده های سلولی ترنسفورم شده در محیط های اسیدی تر (pH 7.0-7.4) بهتر رشد می کنند، و برخی از رده های سلولی طبیعی فیبروبلاست pH برابر 7.4 تا 7.7 را ترجیح می دهند. رده های سلولی حشرات مانند Sf9 و Sf21 در pH 6.2 به طور مطلوب رشد می کنند.
محیط های کشت سلولی با رنگ نشانگر فنل رد تکمیل می شود. رنگ زرد به محیط نشان می‌دهد که pH خیلی پایین است (اسیدی)، رنگ بنفش نشان‌دهنده PH خیلی بالا (قلیایی) می باشد، در حالی که رنگ نارنجی مایل به قرمز نشان می‌دهد که محیط از pH فیزیولوژیکی درستی برخوردار است.
میزان CO2 :
از آنجایی که pH محیط به تعادل دی اکسید کربن محلول (CO2) و بی کربنات (HCO3) وابسته است، تغییرات در CO2 اتمسفر می تواند pH محیط را تغییر دهد. بنابراین، هنگام استفاده از محیط های تنظیم شده با بافر مبتنی بر CO2 بی کربنات، استفاده از CO2 ضروری است، به خصوص اگر سلول ها در ظروف باز یا رده های سلولی ترنسفرم شده در غلظت های بالا کشت شوند. در حالی که اکثر محققان معمولاً از 5-7٪ CO2 استفاده می کنند، 4-10٪ CO2 برای اکثر آزمایش های کشت سلولی رایج تر است.
دمای بهینه:
دمای مطلوب برای کشت سلول تا حد زیادی به دمای بدن میزبانی که سلول‌ها از آن جدا شده‌اند، و تا حد کمتری به تغییرات آناتومیکی در دما بستگی دارد (به عنوان مثال، دمای پوست ممکن است کمتر از دمای ماهیچه‌های اسکلتی باشد). گرمای بیش از حد یک مشکل جدی تر از گرمای کم برای کشت سلولی است. بنابراین، اغلب درجه حرارت در انکوباتور کمی کمتر از دمای بهینه تنظیم می شود.
- اکثر رده های سلولی انسان و پستانداران برای رشد مطلوب در دمای 36 تا 37 درجه سانتیگراد نگهداری می شوند.
- سلول های حشرات در دمای 27 درجه سانتیگراد برای رشد مطلوب کشت داده می شوند. آنها در دماهای پایین تر و در دمای بین 27 تا 30 درجه سانتی گراد رشد کندتری دارند. در دمای بالای 30 درجه سانتیگراد، زنده ماندن سلول های حشرات کاهش می یابد و سلول ها حتی پس از بازگشت به دمای 27 درجه سانتیگراد بهبود نمی یابند.
انواع محیط های کشت:
محیط DMEM:
یکی از پرکاربردترین محیط کشت های تغییر یافته از محیط Eagle است که مقدار ویتامین ها و اسید های آمینه آن نسبت به محیط کشت پایه تقریبا چهار برابر است. محیط DMEM برای کشت اکثر انواع سلول ها از قبیل سلول های انسان، همستر، رت، موش، میمون، مرغ و ماهی مناسب است. فیبروبلاست های اولیه، نورون ها، سلول های گلیال، HUVECها، سلول های ماهیچه صاف به خوبی در این محیط کشت رشد می کنند. اثبات شده که گلوکز اضافه برای کشت سایر رده های سلولی، مانند کشت اولیه سلول های موش و مرغ و همچنین انواع مختلف رده های سلولی طبیعی و ترنسفورم شده ، مناسب است. به طور اختصاصی DMEM high glucose ، یک فرم تغییر یافته از محیط پایه DMEM است که حاوی مقدار بالای گلوکز (5/4 گرم در لیتر) ، 15 میلی مولار HEPES ، ال-گلوتامین، پیروات، بی کربنات سدیم و فنل رد می باشد.
محیط RPMI 1640:
محیط کشت RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) اولین بار برای کشت سلول های لوسمی انسان در محیط معلق و محیط کشت تک لایه استفاده شد. این محیط که به عنوان یک محیط مناسب برای سلول های لنفوبلاستوئید در کشت معلق فرموله شده است، همچنین می تواند برای طیف گسترده ای از سلول های چسبنده نیز مناسب باشد.
ویژگی منحصر به فرد محیط کشت RPMI 1640، داشتن گلوتاتیون به عنوان عامل احیاکننده و همچنین مقادیر زیادی از ویتامین های مختلف است. این محیط کشت حاوی بیوتین، ویتامین B12 و پاراآمینوبنزوئیک اسید است که در محیط کشت EMEM یا DMEM وجود ندارند.
محیط DMEM/F-12:
محیط DMEM/F-12 مخلوطی از DMEM و F12 می باشد تا غلظت های بالاتری از اجزای DMEM را با طیف وسیع تری از مواد تشکیل دهنده F12 Ham's ترکیب کنند. به عنوان مثال، افزودن Ham's F12 اجزایی مانند بیوتین، اسید لیپوئیک، گلایسین، پرولین، مس و روی را فراهم می کند که در DMEM وجود ندارد.
محیط کشت DMEM/F-12 یک محیط کشت پایه بسیار رایج برای رشد انواع مختلف سلول های پستانداران است. سلول هایی مانند MDCK ، سلول های گلیال، فیبروبلاست ها، سلول های اندوتلیال انسان و همچنین فیبروبلاست های موش که این سلول ها به خوبی در محیط کشت DMEM/F12 رشد می کنند. این محصول یک مخلوط از محیط DMEM و محیط مغذی F-12 همراه با گلوتامیکس/ال-گلوتامین، بیکربنات سدیم و فنل رد است است. برای حفظ بهتر pH فیزیولوژیک در غلظت های مختلف دی اکسید کربن، محلول HEPES (هیدروکسیل-پیپرازین اتان سولفونیک اسید)، به عنوان یک عامل بافری به محیط نیز اضافه شده است.
