واکنش زنجیره‌ای پلیمراز که به اختصار PCR   مخفف  Polymerase Chain Reaction  خوانده میشود ، یک روش متداول آزمایشگاهی است که  اصول کار آن ، تکثیر قطعه مشخصی از DNA است.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یک روش آزمایشگاهی تقویت اسید نوکلئیک است که برای دناتوره کردن و تغییر مجدد بخش‌های کوتاه اسید دئوکسی ریبونوکلئیک (DNA) یا ریبونوکلئیک اسید (RNA) با استفاده از آنزیم DNA پلیمراز I، جدا شده از Thermus aquaticus، معروف به Taq DNA استفاده می‌شود. .

در سال 1985، PCR توسط مولیس و همکارانش معرفی شد که برای آن جایزه نوبل دریافت کردند. این یک ابزار به یاد ماندنی است که در علوم زیست مولکولی به دلیل توانایی عمیق آن در بررسی و تشخیص اجزای تقویت‌شده DNA استفاده می‌شود.

PCR روشی است که به طور انتخابی بر روی بخش کوچکی از DNA در یک لوله آزمایش تمرکز می‌کند. پایداری حرارتی تمایل به مقاومت در برابر تغییرات برگشت ناپذیر در خواص شیمیایی و فیزیکی در دماهای شدید را دارد. به دنبال چندین چرخه تکراری دناتوره سازی  در روش های PCR، آنزیم Taq polymerase به دلیل خاصیت پایداری در برابر حرارت ترجیح داده می شود، بنابراین، امکان ادامه سنتز DNA را با وجود قرار گرفتن در معرض پرایمرها فراهم می کند. PCR روش برجسته انتخابی در تشخیص طیف گسترده ای از عفونت های باکتریایی و ویروسی و همچنین غربالگری بیماری های ژنتیکی به دلیل حساسیت بالای آن بوده است که آن را به روش استاندارد طلایی  برای نمونه های متعدد تبدیل کرده است.

فرآیندهای واکنش زنجیره ای پلیمراز با جمع آوری نمونه کوچکی از DNA در یک لوله آزمایش آغاز می شود. PCR از سه مرحله اصلی تشکیل شده است:

  •  Denaturation (دناتوراسیون)
  •  Annealing (اتصال) 
  •  Extension (طویل شدن)

 در طول مرحله دناتوراسیون، DNA تا 95 درجه سانتیگراد (C) ، گرم می شود تا پیوندهای هیدروژنی بین جفت بازهای مکمل DNA دو رشته ای جدا شود. بلافاصله پس از دناتوره شدن، فرآیند اتصال اتفاق می افتد. اتصال شامل خنک کردن DNA دناتوره شده در دمایی بین 37-72 درجه سانتیگراد است که امکان اصلاح پیوندهای هیدروژنی را فراهم می کند. اتصال به بهترین وجه در دمای بین 55 تا 72 درجه سانتیگراد انجام می شود.

دمای ویژه بر اساس خواص فیزیکی و شیمیایی پرایمرهای خاص مورد استفاده در محلول تعیین می شود. پرایمرها 20-25 نوکلئوتید طول دارند. اتصال به پرایمرها اجازه می‌دهد تا به DNA تک رشته‌ای در مکان‌های مکمل مربوطه خود که از انتهای 3' الگوی DNA شروع می‌شوند، متصل شوند. متعاقباً، اتصال پرایمرها به مکان های مکمل خود در DNA تک رشته ای، دو مولکول دو رشته ای را ایجاد می کند. در نهایت، دمای واکنش بهینه، 75-80 درجه سانتیگراد می باشد برای همانندسازی DNA که بستگی به  آنزیم مربوطه دارد تا اطمینان از فعالیت DNA پلیمراز حاصل شود.

به منظور شروع عملکرد DNA پلیمراز، DNA دو رشته ای برای وقوع همانندسازی الزامی است. پس از آن، DNA پلیمراز DNA را در جهت 3 تا 5' سنتز می کند و رشته هایی مشابه با رشته های الگو تولید می کند. این روش چندین بار از طریق یک چرخه حرارتی تکرار می شود. این چرخه حرارتی باعث می شود که زمان و دمای هر سیکل و مراحل مربوط به آن را کنترل  کند. این در نهایت منجر به چندین DNA تکراری در لوله می شود.

پس از سیکل‌های 30-40، چرخه‌های تکراری در نهایت به دلیل توانایی محدود معرف و همچنین سایر عوامل کمک‌کننده مانند تجمع مولکول‌های پیروفسفات، اتصال بیش از حد، و وجود بازدارنده‌های PCR در نمونه، کاهش می‌یابند. مهارکننده های متعددی وجود دارند که می توانند بر عملکرد صحیح PCR تأثیر بگذارند.    رایج ترین مهارکننده های PCR عبارتند از پروتئیناز K، فنل، اتیلن دی آمین تتراستیک اسید (EDTA)

همچنین پروتئیناز K تمایل به تجزیه Taq polymerase را دارد. مواد دیگری که می توانند بر تست های PCR تاثیر منفی بگذارند، شوینده های یونی، هپارین، اسپرمیدین و هموگلوبین هستند.علاوه بر این، رنگ‌های بروموفنول و زایلن سیانول می‌توانند عوارضی در آزمایش PCR ایجاد کنند. برای غلبه بر این مشکلات، الگوهای DNA را می توان با دیالیز و رسوب توسط اتانول پاکسازی کرد. چندین استراتژی دیگر برای تمیز کردن الگوی DNA شامل استفاده از کلروفرم برای اهداف استخراج و کروماتوگرافی است.

الکتروفورز محصولات PCR

برای مشاهده نمونه‌ها روی ژل، هنگام قرار دادن آن‌ها درون چاهک،از رنگ‌های قابل مشاهده با نور UV مانند رنگ DNA safe stain   استفاده می شود.البته در گذشته، از اتیدیوم بروماید برای رنگ‌آمیزی استفاده می‌شد، اما به دلیل سمی و جهش ‌زا بودن آن ها، کار با آن ‌ها در آزمایشگاه ها ممنوع اعلام شد. پس از پایان حرکت مولکول‌ها به سمت قطب مخالف، جریان الکتریکی قطع می‌شود و ژل توسط دستگاهی به نام ژل داک تصویربرداری میشود.

با این تکنیک کاربر قادر به شناسایی مولکولهای DNA با طول های متفاوت است. از آنجاییکه مولکول‌های DNA دارای بار منفی هستند زمانی که روی ژل  و تحت جریان الکتریی قرار میگیرند به سمت الکترود مثبت حرکت می‌کنند. در این شرایط ، جداسازی مولوکول های DNA ، تنها بر اساس اندازه و سایز آنها انجام می‌شود. حرکت رشته‌های کوتاه DNA سرعت بیشتری نسبت به مولکول‌های بلندتر دارند، بنابراین جداسازی  مولکول‌های DNA با اندازه‌های متفاوت آسان تر انجام میشود.همانطور که قبلا هم اشاره کردیم ردیابی نمونه ها، با اضافه کردن رنگهای فلورسنت درون چاهک ژل  انجام میگیرد. بعضی از کاربران، رنگ‌های فلورسنت را با ژل ، درست قبل از انتقال آن به قالب الکتروفورز مخلوط میکنند که در این شرایط ، نیاز به اضافه کردن رنگ هنگام لود نمونه  نیست. الکتروفورز برای مولکول‌های‌ DNA به صورت افقی انجام می‌گیرد که روشی ساده‌تر نسبت به روش عمودی است.

بعد از توقف جریان، باند مولکول‌های DNA در اندازه‌های مختلف بر روی ژل نمایان است که جهت تعیین اندازه باند نمونه، از یک نشانگر و یا در اصطلاح  (Ladder) به عنوان استاندارد استفاده می‌شود.لدر روی ژل به صورت باندهایی با طول معین نمایان بوده و با استفاده از آن اندازه باندهای نمونه بر روی ژل را می توان ارزیابی کرد.

به طور خلاصه استفاده از PCR در علوم پایه و زیست پزشکی مزایای مختلفی دارد. در طول سال ها، به دلایل متعدد این روش به روش گلدن استاندارد تبدیل شده اشت . اولاً، به دلیل توانایی خود در تولید نتایج سریع به شیوه ای کارآمد از نظر زمان شناخته شده است. روش PCR معمولاً به چند ساعت تا 3 روز برای ایجاد نتایج نیاز دارد. نمونه کوچکی از DNA یا RNA (0.1-5 میکروگرم) برای انجام این واکنش ضروری است. PCR همچنین این استعداد را دارد که 106 تا 109 نسخه از DNA را در مدت زمان کوتاهی تکثیر کند. PCR به دلیل وجود مکان های محدود کننده در انتهای ترمینال، توانایی تولید محصولات تقویت کارآمد را پس از شبیه سازی و بیان دارد.