cDNA یا DNA مکمل ، یک مولکول DNA تک رشته ای است که از یک الگوی RNA پیام رسان (mRNA) سنتز می شود. فرآیند سنتز cDNA یک تکنیک مهم در زیست‌شناسی مولکولی و بیوتکنولوژی است، زیرا امکان  مطالعه ژن‌ها یا توالی ‌های ژنتیکی خاص را فراهم می‌کند.

سنتز cDNA کاربردهای گسترده ای در تحقیقات و بیوتکنولوژی دارد که برخی از موارد کلیدی عبارتند از:

  • تجزیه و تحلیل بیان ژن:

از cDNA می توان برای مطالعه سطح بیان ژن های خاص در انواع سلول ها، بافت ها یا شرایط مختلف استفاده کرد.این اغلب با استفاده از تکنیک هایی مانند PCR کمی(qPCR) یا توالی یابی RNA (RNA-seq) انجام می شود.

  • شبیه سازی و تولید پروتئین نوترکیب:

cDNA را می توان در ناقل های بیانی کلون کرد و برای تولید پروتئین های نوترکیب در سیستم های میزبان مختلف مانند سلول های باکتری، مخمر یا پستانداران استفاده کرد.

این برای تولید پروتئین‌های درمانی، آنزیم‌ها و سایر پروتئین‌های با ارزش تجاری مهم است.

  • تجزیه و تحلیل رونوشت:

از کتابخانه‌های cDNA می‌توان برای مطالعه مجموعه کامل رونوشت‌ها (ترانسکریپتوم) بیان شده در یک سلول یا بافت استفاده کرد.

این بینشی در مورد تنظیم ژن، پیوند جایگزین و فرآیندهای سلولی کلی ارائه می دهد.

  • شناسایی ژن های جدید:

کتابخانه های cDNA را می توان برای کشف و شناسایی ژن های ناشناخته قبلی غربالگری کرد.

این به ویژه در مطالعه موجودات غیرمدل یا برای شناسایی رونوشت های کمیاب یا کم فراوان مفید است.

  • توسعه تشخیصی و بیومارکر:

از cDNA می توان برای توسعه سنجش های تشخیصی و شناسایی نشانگرهای زیستی بالقوه برای بیماری ها یا شرایط مختلف استفاده کرد.

این شامل تشخیص الگوهای بیان ژن خاص مرتبط با بیماری ها است که می تواند به تشخیص و نظارت زودهنگام کمک کند.

  • ساخت واکسن و دارو:

از cDNA می توان برای بیان پروتئین ها یا آنتی ژن های خاص استفاده کرد که می تواند در ساخت واکسن ها یا داروهای درمانی استفاده شود. این امر به ویژه در زمینه ایمونولوژی و تحقیقات بیماری های عفونی اهمیت دارد.

مراحل اصلی در سنتز cDNA به شرح زیر است:

به منظور ارزیابی میزان بیان ژن‎ها، لازم است ابتدا RNA های یک سلول استخراج شود تا از روی آن‌ها به کمک آنزیم Reverse Transcriptase یک مولکول DNA مکمل یا همان (Complementary DNA) که موسوم به cDNA است، ساخته شود. آنزیم Reverse Transcriptase نوعی پلیمراز وابسته به RNA است که همانند تمام پلیمراز های دیگر برای ساخت DNA علاوه بر dNTP ها به یک پرایمر کوتاه نیاز دارد. پس از ساخت cDNA امکان آنالیز کمی میزان بیان ژن مربوطه توسط واکنش های Real-Time PCR فراهم می‌گردد.

۱.استخراج RNA

اولین قدم استخراج  mRNA یا  RNA)پیام رسان ( از سلول ها یا بافت های هدف است. این معمولاً با استفاده از روش‌های مختلف استخراج RNA مانند استخراج گوانیدینیم تیوسیانات-فنل-کلروفرم یا خالص‌سازی مبتنی بر ستون انجام می‌شود.

۲.اتصال یا (Annealing  ) پرایمر:

هنگامی که mRNA جدا شد، یک توالی DNA کوتاه به نام پرایمر به mRNA اضافه می شود. آغازگر به عنوان نقطه شروع برای واکنش رونویسی معکوس عمل می کند.

۳. رونویسی معکوس:

سپس از آنزیم ترانس کریپتاز معکوس برای سنتز یک رشته DNA مکمل (cDNA) از الگوی mRNA استفاده می شود. این آنزیم می تواند پرایمر را شناسایی کرده و از آن برای شروع سنتز رشته cDNA استفاده کند.

۴.سنتز رشته دوم:

پس از سنتز cDNA رشته اول، رشته DNA دوم برای ایجاد یک مولکول cDNA دو رشته ای سنتز می شود. این معمولاً با استفاده از DNA پلیمراز و RNase H انجام می شود که الگوی    mRNA  ا صلی را تخریب می کند.

۵.تقویت یا Amplification :

بسته به کاربرد، cDNA را می توان با استفاده از تکنیک هایی مانند واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) برای تولید کپی های متعدد از توالی هدف تقویت کرد.

مراحل کلیدی در فرآیند سنتز cDNA عبارتند از:

  • استخراج RNA
  •  اتصال پرایمر
  • رونویسی معکوس
  • سنتز رشته دوم
  •   تقویت یا Amplification 

این مراحل امکان تبدیل mRNA را به یک مولکول cDNA دو رشته ای پایدار می دهد که می تواند برای کاربردهای مختلف در زیست شناسی مولکولی، بیوتکنولوژی و تحقیقات زیست پزشکی استفاده شود.

 cDNA حاصل می تواند برای کاربردهای مختلفی مانند تجزیه و تحلیل بیان ژن، شبیه سازی یا تولید پروتئین های نوترکیب استفاده شود.

توجه به این نکته مهم است که پروتکل‌ها و معرف‌های خاص مورد استفاده برای سنتز cDNA ممکن است بسته به نیازهای تحقیق یا کاربرد متفاوت باشد.

 همچنین سنتز cDNA نقش مهمی در توسعه ابزارهای تشخیصی جدید و درمان‌های درمانی دارد:

  • کشف و اعتبار سنجی بیومارکر:

سنتز cDNA امکان  شناسایی ژن‌ها یا رونوشت‌هایی با بیان متفاوت را فراهم می‌کند که ممکن است به عنوان نشانگرهای زیستی بالقوه برای بیماری‌ها عمل کنند.

با تجزیه و تحلیل کتابخانه‌های cDNA از نمونه‌های بیمار و سالم، محققان می‌توانند الگوهای بیان ژن منحصربه‌فردی را کشف کنند که می‌توانند به عنوان نشانگرهای تشخیصی یا پیش آگهی مورد استفاده قرار گیرند.

سپس این بیومارکرها می‌توانند اعتبار بیشتری داشته باشند و به آزمایش‌های تشخیصی مانند سنجش‌های مبتنی بر PCR تبدیل شوند.

  • شناسایی هدف درمانی:

سنتز cDNA امکان مطالعه پروفایل های بیان ژن در بافت ها یا سلول های بیمار را فراهم می کند، که می تواند به شناسایی ژن ها یا مسیرهایی که تنظیم نشده و در پاتوژنز یک بیماری کمک می کنند، تاثیر گذار باشند.

سپس این ژن‌های بیان شده متفاوت یا مسیرهای سیگنال دهی تغییر یافته می‌توانند به عنوان اهداف درمانی بالقوه برای توسعه دارو ارزیابی شوند.

با درک مکانیسم‌های مولکولی زمینه‌ای یک بیماری، محققان می‌توانند درمان‌های هدفمندی مانند مهارکننده‌های مولکولی کوچک، آنتی‌بادی‌های مونوکلونال یا درمان‌های مبتنی بر ژن را برای رسیدگی به علل ریشه‌ای این بیماری طراحی کنند.

  • تولید پروتئین نوترکیب:

سنتز cDNA برای تولید پروتئین های نوترکیب ضروری است که می توانند به عنوان عوامل درمانی مانند آنزیم ها، آنتی بادی ها یا هورمون ها مورد استفاده قرار گیرند.

cDNA کد کننده پروتئین مورد نظر در یک ناقل بیانی کلون می شود و سپس برای تولید پروتئین در سیستم های میزبان مختلف مانند سلول های باکتری، مخمر یا پستانداران استفاده می شود.

این پروتئین های نوترکیب را می توان خالص سازی کرد و به عنوان داروهای درمانی و همچنین برای توسعه آزمایش های تشخیصی و واکسن ها استفاده کرد.

  • توسعه واکسن:

سنتز cDNA امکان شناسایی و بیان آنتی ژن ها یا اپی توپ های خاصی را می دهد که می توانند در ساخت واکسن استفاده شوند.

محققان می توانند از کتابخانه های cDNA برای غربالگری استفاده کنند، که سپس می توانند به عنوان پروتئین های نوترکیب تولید شوند یا در رویکردهای واکسن مبتنی بر DNA استفاده شوند.

این اجازه می دهد تا واکسن های موثرتر و هدفمندتری علیه بیماری های عفونی، سرطان یا سایر شرایط ایجاد شود.

  • پزشکی شخصی:

سنتز cDNA می تواند با فعال کردن تجزیه و تحلیل پروفایل های بیان ژن فردی یا تغییرات ژنتیکی به حوزه پزشکی شخصی کمک کند.

این اطلاعات را می توان برای تنظیم تست های تشخیصی، پیش بینی خطر بیماری، و توسعه استراتژی های درمانی شخصی بر اساس ویژگی های ژنتیکی و مولکولی منحصر به  فرد مورد استفاده قرار داد.

تطبیق پذیری سنتز cDNA آن را به ابزاری اساسی در تحقیقات زیست شناسی مولکولی، ژنومیک و بیوتکنولوژی مدرن تبدیل می کند. توانایی تولید و دستکاری cDNA برای پیشرفت درک ما از عملکرد ژن، مکانیسم های بیماری و توسعه کاربردهای مختلف در پزشکی و صنعت بسیار مهم بوده است.

به طور کلی، توانایی سنتز و دستکاری cDNA در پیشرفت درک ما از مکانیسم‌های بیماری مفید بوده و توسعه طیف گسترده‌ای از ابزارهای تشخیصی و درمان‌های درمانی را که خاص‌تر، مؤثرتر و شخصی‌تر هستند، ممکن ساخته است.