انواع PCR

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) یک تکنیک پرکاربرد در زیست شناسی مولکولی برای تقویت توالی های خاص DNA است. PCR  با کاربردهای متنوعی است که بر سلامت، بیماری ها ، ژنتیک ، علوم سلولی، کشاورزی و علوم محیطی تأثیر می گذارد. توانایی آن در تقویت سریع و دقیق DNA، انقلابی در تشخیص، تحقیقات و بسیاری از زمینه های دیگر ایجاد کرده است.

انواع مختلفی از PCR وجود دارد که هر کدام اهداف متفاوتی دارند. در اینجا چند نوع رایج وجود دارد:

PCR  استاندارد:

شکل اصلی PCR که برای تکثیر DNA استفاده می شود.

فرآیند آن شامل چرخه های مکرر دناتوراسیون (جداسازی رشته ها DNA) ، بازپخت (اتصال پرایمرها به توالی های هدف) و گسترش(سنتز رشته های DNA جدید)

Real-Time PCR (qPCR) :

امکان تعیین کمیت DNA را در زمان واقعی در طول فرآیند تقویت فراهم می کند.

فرآیند آن به این صورت است که از رنگ های فلورسنت برای نظارت بر تکثیر DNA استفاده می کند و داده های کمی در مورد مقدار DNA هدف موجود ارائه می دهد.

PCR  رونویسی معکوس (RT-PCR):

برای تقویت توالی های RNA با تبدیل آنها به DNA مکمل (cDNA) استفاده می شود.

فرآیند آن شامل رونویسی معکوس RNA به  cDNA  و به دنبال آن تکثیر استاندارد cDNA است.

Multiplex PCR :

Multiplex PCR یک تکنیک متداول بیولوژی مولکولی است که برای تکثیر چندین هدف در یک آزمایش PCR استفاده می‌شود.

فرآیند آن به این صورت است که در Multiplex PCR، از پرایمرهای متعدد و یک DNA پلیمراز با واسطه دما برای تکثیر DNA در یک سیکلر حرارتی استفاده می‌شود. تمام جفت‌های پرایمرهای طراحی شده برای     Multiplex PCR  باید بهینه شوند تا دمای آنیلینگ یکسان برای همه جفت‌ها در طول PCR بهینه باشد.

هنگامی که چندین توالی به طور هم‌زمان مورد هدف قرار می‌گیرند، اطلاعات اضافی را می‌توان از یک آزمایش واحد تولید کرد که در غیر این صورت به مقدار بیشتری از معرف‌ها و زمان و تلاش گسترده برای انجام نیاز دارد. این فناوری در بسیاری از زمینه‌ها مانند ژنوتایپینگ، تجزیه و تحلیل جهش و پلی‌مورفیسم، تجزیه و تحلیل توالی‌هاSTR  ، تشخیص پاتوژن‌ها یا ارگانیسم‌ های اصلاح شده ژنتیکی و غیره استفاده شده است.

در آزمایشگاه‌های تشخیصی، Multiplex PCR  برای شناسایی میکروارگانیسم‌های مختلف که باعث بیماری‌های مشابه می‌شوند مفید است.

Nested PCR :

Nested PCR یک اصلاح مفید در فناوری PCR است که در طی آن، ویژگی واکنش با جلوگیری از اتصال غیراختصاصی با کمک دو مجموعه پرایمر افزایش می‌یابد.

فرایند آن به این صورت است که اولین مجموعه پرایمر به خارج از DNA هدف ما متصل می‌شود و قطعه بزرگ‌تر را تکثیر می‌کند در حالی که مجموعه دیگر پرایمر به طور خاص در محل هدف متصل می‌شود.در دور دوم تکثیر، مجموعه دوم پرایمر تنها DNA هدف را تکثیر می‌کند.

Nested PCR روشی مفید برای مطالعات فیلوژنتیکی و تشخیص پاتوژن‌های مختلف است،این تکنیک حساسیت بالایی دارد. از این رو حتی اگر نمونه حاوی DNA کمتری باشد، می‌توان آن را تکثیر کرد که در روش PCR معمولی امکان پذیر نیست.

Touch Down PCR :

ویژگی را با کاهش تدریجی دمای Annealing در چرخه های متوالی بهبود می بخشد.

Touch Down PCR اصلاح شده PCR است که در آن دمای آنیلینگ اولیه بالاتر از Tm بهینه پرایمرها است و به تدریج در چرخه‌های بعدی تا رسیدن به دمای Tm یا “دمای تاچ داون” کاهش می‌یابد.

Touch Down PCR ویژگی واکنش را در دماهای بالاتر افزایش می‌دهد و با کاهش دمای بازپخت راندمان را تا انتها افزایش می‌دهد.

Hot Start PCR  :

 با جلوگیری از فعال شدن پلیمراز تا زمانی که واکنش به دمای معینی برسد، تقویت غیر اختصاصی را کاهش می دهد.

Hot start PCR شکل جدیدی از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز معمولی (PCR) است که به دلیل تکثیر غیراختصاصی DNA در دمای اتاق، بروز محصولات نامطلوب و تشکیل پرایمر – دایمرها را کاهش می‌دهد. اصل اساسی در این روش، جداسازی یک یا چند معرف از مخلوط واکنش است تا زمانی که مخلوط به دمای دناتوراسیون برسد.

Hot start PCR به طور قابل توجهی اتصال غیراختصاصی، تشکیل پرایمر – دایمرها را کاهش می‌دهد و اغلب بازده محصول را افزایش می‌دهد. همچنین به تلاش کمتری نیاز دارد و خطر آلودگی را کاهش می‌دهد

In-situ PCR  :

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز درجا/در محل (In-situ PCR) روشی مؤثر است که مقادیر کمی از توالی‌های اسیدنوکلئیک نادر را در سلول‌ها یا بخش‌های بافتی منجمد یا جاسازی‌شده در پارافین برای تقسیم‌بندی آن توالی‌ها در سلول‌ها تشخیص می‌دهد.

این روش شامل تثبیت بافتی است که مورفولوژی سلولی را حفظ می‌کند و سپس با درمان با آنزیم‌های پروتئولیتیک دنبال می‌شود تا ورود واکنش‌های PCR به DNA هدف ارائه شود.

توالی‌های هدف توسط معرف‌ها تکثیر شده و سپس توسط پروتکل‌های ایمونوسیتوشیمی استاندارد شناسایی می‌شوند In-situ PCR.برای تشخیص بیماری‌های عفونی، تعیین کمیت DNA و یا تشخیص حتی مقدار کمی از DNA کاربرد دارد و به طور گسترده در مطالعه ارگانوژنز و جنین‌زایی استفاده می‌شود.

هر یک از انواع PCR مزایا و کاربردهای خاص خود را دارد که PCR را به ابزاری همه کاره در زمینه ژنتیک، تشخیص و تحقیقات تبدیل می کند