استخراج RNA فرآیند جداسازی و خالص سازی مولکول های RNA از نمونه های بیولوژیکی مانند سلول ها، بافت ها یا مایعات بدن است. متداول‌ترین روش‌های استخراج RNA ،از مخلوط اسیدی فنل/گوانیدینیم ایزوتیوسیانات برای غیرفعال کردن RNaseها استفاده می‌کنند و امکان جداسازی اسیدهای نوکلئیک از سایر اجزای سلولی فراهم میکند.
به طور کلی، استخراج RNA یک مرحله حیاتی در بسیاری از کاربردهای زیست شناسی مولکولی و ژنومیکس است، زیرا ماده اولیه را برای تجزیه و تحلیل های پایین دستی مانند مطالعات بیان ژن، رونویسی معکوس و توالی یابی نسل بعدی (NGS ) فراهم می کند.
در طول فرآیند استخراج، نمونه ابتدا لیز می شود تا RNA آزاد شود و سپس RNA از DNA ، پروتئین ها و سایر بقایای سلولی از طریق یک سری محلول ها و مراحل سانتریفیوژ و شستشو جدا می شود. نمونه نهایی RNA معمولاً در حجم کمی از بافر یا آب وجود دارد.
دو روش برای استخراج RNA وجود دارد :
روش اول : استفاده از کیت می باشد که کیت های تجاری مختلفی برای استخراج RNA در دسترس هستند، مانند کیت سلولی Maxwell® RSC simpleRNA، که می تواند RNA کل را از سلول های تازه یا منجمد استخراج کند.
روش دوم : روش استخراج دستی یا فنل/گوانیدینیم ایزوتیوسیانات، همچنین به عنوان استخراج AGPC (اسید گوانیدینیم تیوسیانات-فنل-کلروفرم) نیز شناخته می شود، یک تکنیک پرکاربرد برای جداسازی RNA می باشد.
اجزای اصلی این روش عبارتند از:
ایزوتیوسیانات گوانیدینیوم (GTC): یک عامل کائوتروپیک قوی که پروتئین ها را دناتوره می کند و RNase ها ( آنزیم هایی که می توانند RNA را تجزیه کنند ) را غیر فعال می کند.
فنل: یک حلال آلی که به جداسازی RNA از DNA و پروتئین ها کمک می کند.
کلروفرم: حلال آلی دیگری که جداسازی فاز آبی حاوی RNA را از DNA و فاز آلی حاوی پروتئین افزایش می دهد.
این فرآیند شامل:
لیز کردن سلول ها یا بافت ها در محلولی حاوی GTC، که غشای سلولی را مختل می کند و محتویات سلولی را آزاد می کند.
افزودن فنل و کلروفرم به سلول های لیز شده یک مخلوط دوفازی ایجاد می کند. RNA به فاز آبی بالایی تقسیم می شود، در حالی که DNA و پروتئین ها در فاز آلی پایینی باقی می مانند.
برای رسوب RNA از فاز آبی از ایزوپروپانول یا اتانول استفاده می شود.
این روش در جداسازی RNA در کیفیت بالا و دست نخورده از انواع مختلف نمونه از جمله سلول ها، بافت ها و حتی نمونه های گیاهی موثر است. pH اسیدی و وجود GTC به دناتوره کردن RNaseها کمک می کند و از RNA در برابر تخریب در طول فرآیند استخراج محافظت می کند.
پروتکل استخراج RNA :
۱. آماده سازی نمونه:
- برای سلول های کشت: محیط را خارج کنید، با PBS کامل بشویید و TRIZol یا بافر لیز کننده دیگری را اضافه کنید. سلول را درون یک میکروتیوپ ۱.۵ میلی لیتری بریزید.
- به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق بگذارید
- برای بافت ها: نمونه را در TRIZol یا بافر لیز کننده همگن کنید.
۲. جداسازی فاز:
- کلروفرم را اضافه کنید و خوب مخلوط کنید. ( میکروتیوپ را به مدت ۱۵ ثانیه با شدت تکان دهید)
- به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق بگذارید.
- برای جداسازی فازهای آبی (حاوی RNA) و آلی ، در ۱۰۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ کنید.
- در این مرحله، در هر لوله سه لایه وجود دارد:
لایه بالایی: شفاف، آبی
لایه میانی: DNA به شکل رسوب سفید است
لایه پایین: فاز ارگانیک صورتی
۳. رسوب RNA:
- فاز آبی را به یک لوله جدید منتقل کنید .
- ایزوپروپانول را به فاز آبی اضافه کرده و به آرامی مخلوط کنید.
- به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق بگذارید.
- سانتریفیوژ با حداکثر سرعت (۱۴۰۰۰ دور در دقیقه) به مدت ۲۰ دقیقه.
۴. شستشو:
- رسوب RNA را با اتانول ۷۰ درصد بشویید تا هر گونه آلودگی باقیمانده از بین برود.
( سانتریفیوژ در ۹۵۰۰ دور در دقیقه به مدت ۵دقیقه )
۵. تعلیق مجدد:
- اتانول را دور بریزید و بگذارید رسوب بدست آمده در هوا خشک شود. این یک مرحله مهم است؛ اگر رسوب بیش از حد خشک شود، RNA متبلور می شود و حل مجدد آن بسیار دشوار است. اگر به اندازه کافی از اتانول تبخیر نشود، این نیز از ورود RNA به محلول جلوگیری می کند. پس از ریختن بخش عمده ای از اتانول شستشو، تقریباً ۳۰-۴۰ میکرولیتر در ته میکروتیوپ باقی خواهد ماند. برای سرعت بخشیدن به تبخیر، تا می توانید با پیپت اتانول را بکشید بدون آنکه به رسوب آسیبی برسد.
- رسوب RNA را مجدداً در آب بدون RNase یا DEPC مناسب حل کنید. بهترین زمان برای اضافه کردن آب تصفیه شده یا DEPC به رسوب RNA زمانی است که تنها یک هلال کوچک از محلول در اطراف رسوب باقی مانده است.
۶. DNase Treatment:
- اگر آلودگی DNA نگران کننده است، یک DNase Treatment برای حذف DNA ژنومی باقیمانده انجام دهید.
جزئیات دقیق ممکن است بسته به کیت یا پروتکل خاص مورد استفاده متفاوت باشد، اما این گردش کار عمومی در بسیاری از روش‌های استخراج RNA رایج است. استفاده از موادی مانند نمک‌های گوانیدینیم و حلال‌های آلی به دناتوره کردن پروتئین‌ها، غیرفعال کردن RNase ها و جداسازی انتخابی مولکول‌های RNA کمک میکند.
