Real-time PCR، که به عنوان PCR کمی (qPCR) نیز شناخته می‌شود، یک تکنیک زیست‌شناسی مولکولی قدرتمند است که برای تقویت و تعیین کمیت همزمان یک مولکول DNA هدف استفاده می‌شود. این تکنیک با ارائه روشی سریع و دقیق برای اندازه‌گیری سطوح DNA در زمان واقعی، انقلابی در زمینه ژنتیک، تشخیص و تحقیقات ایجاد کرده است. Real-time PCR (qPCR) به دلیل حساسیت، ویژگی و توانایی آن در ارائه داده های کمی، به یک تکنیک سنگ بنای هم در تحقیقات و هم در تشخیص تبدیل شده است.
اصول و پایه Real-Time PCR
PCR سنتی مقدار DNA را فقط در پایان فرآیند تکثیر اندازه گیری می کند، در حالی که Real-Time PCR امکان اندازه گیری DNA در حال تکثیر را فراهم می کند. این امر از طریق استفاده از رنگ‌های فلورسنت یا پروب‌هایی حاصل می‌شود که هنگام اتصال به DNA، فلورسانس منتشر می‌کنند.
- رنگ های فلورسنت: رنگ های بینابینی مانند SYBR Green به DNA دو رشته ای متصل شده و فلورسانس منتشر می کنند. افزایش فلورسانس با مقدار DNA تولید شده در هر چرخه متناسب است.
- تشخیص مبتنی بر پروب: کاوشگرهای خاص، مانند پروب های TaqMan، برای هیبرید شدن با توالی DNA هدف طراحی شده اند. این پروب ها حاوی یک رنگ گزارشگر فلورسنت و یک خاموش کننده هستند. هنگامی که پروب دست نخورده است، خاموش کننده فلورسانس را سرکوب می کند. در طی amplification، پروب شکاف داده می شود و رنگ گزارشگر آزاد می شود و امکان تشخیص فلورسانس وجود دارد
کاربردهای Real-Time PCR
Real-time PCR طیف گسترده ای از کاربردها را دارد، از جمله:
کاربردهای تحقیقاتی
- تجزیه و تحلیل بیان ژن: محققان از qPCR برای تعیین کمیت سطوح mRNA استفاده می کنند و بینش هایی را در مورد تنظیم بیان ژن ارائه می دهند.بررسی اثرات درمان ها، تغییرات محیطی یا مراحل رشد بر بیان ژن.
- ژنوتیپ: می توان از Real-Time PCR برای تعیین تغییرات ژنتیکی و پلی مورفیسم ها استفاده کرد.
شناسایی تغییرات ژنتیکی، پلی‌مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی (SNPs) و جهش‌ها.
- مطالعه تنوع ژنتیکی در جمعیت ها و گونه ها
- تشخیص پاتوژن: شناسایی و تعیین کمیت پاتوژن های ویروسی، باکتریایی و قارچی در مطالعات تحقیقاتی ،درک بار پاتوژن و ارتباط آن با شدت بیماری
- پایش محیط زیست: ارزیابی جوامع میکروبی در اکوسیستم های مختلف
پایش تنوع زیستی و سلامت اکولوژیکی از طریق کمی سازی DNA
- تجزیه و تحلیل گیاهان تراریخته: ارزیابی حضور و سطوح بیان ژن های تراریخته در موجودات اصلاح شده ژنتیکی.
کاربردهای تشخیصی
- تشخیص بیماری عفونی: تشخیص سریع پاتوژن ها (مانند HIV، SARS-CoV-2، سل) در نمونه های بالینی.
پایش بار ویروسی در بیماران برای مدیریت درمان موثر
- تشخیص سرطان: تشخیص تغییرات ژنتیکی خاص مرتبط با سرطان های مختلف.
پایش حداقل بیماری باقیمانده (MRD) برای ارزیابی اثربخشی درمان.
- غربالگری اختلالات ژنتیکی: شناسایی جهش های مسئول بیماری های ارثی
غربالگری نوزادان از نظر اختلالات ژنتیکی با استفاده از لکه های خونی خشک شده
- فارماکوژنومیک: تجزیه و تحلیل تغییرات ژنتیکی که بر متابولیسم و پاسخ دارو تأثیر می گذارد.
طراحی پزشکی شخصی بر اساس مشخصات ژنتیکی.
- پایش بیماری خود ایمنی: کمی سازی اتوآنتی بادی ها یا بیان ژن های خاص مربوط به شرایط خودایمن
مزایای Real-Time PCR :
- حساسیت: Real-time PCR می تواند سطوح پایین DNA را تشخیص دهد و آن را بسیار حساس می کند.
- سرعت: نتایج را می توان در چند ساعت به دست آورد که امکان تصمیم گیری سریع در محیط های بالینی را فراهم می کند.
- داده های کمی: داده های کمی را فراهم می کند و امکان مقایسه بین نمونه ها را فراهم می کند.
محدودیت های Real-Time PCR :
- ویژگی: تقویت غیر اختصاصی ممکن است رخ دهد که منجر به مثبت کاذب شود. طراحی دقیق پرایمر و پروب ضروری است.
- هزینه: تجهیزات و معرف ها ممکن است گران باشند، که ممکن است دسترسی را در برخی از آزمایشگاه ها محدود کند.
پروتکل :
اینجا یک پروتکل کلی برای انجام Real-time PCR (qPCR) آمده است. مشخصات ممکن است بسته به DNA هدف، پرایمرها و تجهیزات مورد استفاده متفاوت باشد، اما این طرح کلی پایه محکمی را فراهم می کند.
مواد مورد نیاز :
- الگوی DNA (DNA ژنومی یا cDNA)
- پرایمر های Forward و reverse
- مسترمیکس (حاوی DNA پلیمراز، dNTPs، بافر و رنگ یا پروب فلورسنت)
- آب بدون نوکلئاز
تجهیزات:
- دستگاه Real-time PCR (دستگاه qPCR)
- سمپلر و سر سمپلر
- میکروتیوپ ۰/۲
- Vortex
- سانتریفیوژ (در صورت نیاز)
مراحل پروتکل :
- همه معرف ها را روی یخ ذوب کنید.
یک ترکیب واکنش معمولی شامل موارد زیر باشد:
مخلوط اصلی ۱۰ میکرولیتر می باشد
- ۰/۵ میکرولیتر پرایمر forward (۱۰ میکرومولار)
- ۰/۵ میکرولیتر پرایمر (۱۰ میکرومولار)
- ۱ میکرولیتر از DNA (در صورت لزوم رقیق شده)
- ۵ میکرولیتر مسترمیکس
- ۳ میکرولیتر آب بدون نوکلئاز
به آرامی با پیپت کردن به بالا و پایین مخلوط کنید و سپس برای مدت کوتاهی سانتریفیوژ کنید.
.
تنظیم دستگاه qPCR:
شرایط چرخه حرارتی را تنظیم کنید. یک برنامه معمولی شامل موارد زیر باشد:
Initial Denaturation در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد به مدت ۲-۵ دقیقه
Amplification Cycles : (معمولاً ۴۰ سیکل)
Denaturation: دردمای۹۵ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵-۳۰ ثانیه
Annealing:در دمای ۵۰-۵۶ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ ثانیه (دما به Tm پرایمر بستگی دارد)
Extension:در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد به مدت۳۰ ثانیه
Final Extension: در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰-۵ دقیقه
اجرای qPCR:
لوله های PCR را در دستگاه real-time PCR قرار دهید.
تجزیه و تحلیل داده ها:
پس از اتمام اجرا، داده ها را با استفاده از نرم افزار ارائه شده با دستگاه qPCR تجزیه و تحلیل کنید.
در صورت نیاز به تعیین کمیت، یک منحنی استاندارد ایجاد کنید و مقادیر نسبی یا مطلق DNA هدف را محاسبه کنید.
نتیجه گیری :
Real-time PCR یک ابزار همه کاره و ضروری در زیست شناسی مولکولی مدرن است. توانایی آن در تعیین کمیت DNA در زمان واقعی آن را در تحقیقات، تشخیص بالینی و کاربردهای مختلف در زمینه های مختلف ارزشمند کرده است. با پیشرفت فناوری، می‌توانیم انتظار پیشرفت‌های بیشتری در حساسیت، سرعت و مقرون به صرفه بودن آن داشته باشیم و کاربردهای آن را بیش از پیش گسترش دهیم.
